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普马拉型汉坦病毒属布尼亚病毒科汉坦病毒属，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，基因组包括L、M、S三个片段，分别编码L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核衣壳蛋白。此前，普马拉型汉坦病毒已被证实能够导致流行性肾病，该病一般认为主要在欧洲流行，是欧洲急性肾衰竭的最常见原因。近年，在韩国、日本及我国东北地区也出现了普马拉型汉坦病毒感染。因此普马拉型汉坦病毒的快速准确鉴定对流行性肾病的预防和检疫有重要作用。

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
   
2. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少100拷贝/反应。
   
3. 根据普马拉型汉坦病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
   
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
   
5. 本制品既可用于定性检测，也可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少有5个数量级。
   
6. 本制品足够50次20μL体系的RT-PCR反应。
   
7. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
2. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
3. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
5. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

6. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上得到的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
   
7. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

8. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
9. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：

   成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR阳性对照 (1～6管)
   2×SYBR qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
   10×SYBR qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL
   普马拉型汉坦病毒染料法qRT-PCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
   N+2个RNA模板	6μL	不加	不加
   自备超纯水	不加	6μL	不加
   第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	不加	不加	各6μL

10. 上机后按下面参数进行RT-PCR。
    

    过程	温度	时间
    RT(逆转录)	50℃	30min
    预变性	95℃	10min
    PCR反应 (35个循环)	95℃	15sec
    	60℃	60sec(采集SYBR通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行溶解曲线分析

    注意：循环次数最好不要超过35次。

11. 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品)，归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
    
12. 如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
    
13. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照)是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
    
14. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
    
15. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。